NOVA Lite ANA KSL 708390

 

NOVA Lite™ ANA KSL                                                                   708390

Harici Teşhiste Kullanılır

 

 

İndirekt immünofloresan bir sistem içeren bu test,insan serumunda bulunan ANA,AMA,ASMA ve GPA antikorlarının tarama ve yarı nicel tayininde kullanılan bir yöntemdir.

 

 

TESTİN AÇIKLAMASI

 

Terim olarak anti nükleer antikorlar, çeşitli otoantikorların reaksiyona girdiği ve hücreyi birlikte oluşturduğu DNA, RNA, çeşitli proteinler ve ribonükleo proteinleri kapsar. Bu otoantikorlar, yüksek frekanslı bağ doku, römatizmal hastalıklar ve SLE hastalarında oluşmaktadır. Hemen hemen bütün SLE hastalarında ANA pozitiftir. ANA için bu testin doğruluğu ilk olarak 1982’de Kriterleri değerlendirme SLE klasifikasyonuna göre Amerikan Koleji Römatoloji alt Komitesi tarafından onaylanmıştır. ANA testi SLE için çok iyi bir taramaa testidir fakat bu testin spesifik olduğu anlamına gelmez. Diğer bağ doku hastalıklarında, Römatoid Artritlerde, Sklerodemada ve Dermamiositisde de ANA pozitiftir. Diğer hastalıklarda ve normal popülasyondaki düşük titre ANA pozitif baz olarak alınmamalıdır.

Pozitif ANA sonuçları, şiddetli yanıkların ve viral enfeksiyonların sonrasında veya sağlıklı görünen insanlarda özellikle yaşlılarda da oluşabilir. Bu testin spesifitesi ANA pozitif hastaların son noktaya kadar titre edilmesine bağlıdır. Ve böylece çift sarmalı DNA ve ENA otoantikorlarına karşı daha spesifiktir.

Yüksek değerde AMA sık sık sirozda görülmektedir. Düşük titreli AMA, diğer karaciğer hastalıklarında örneğin kronik aktif hepatit ve kriptojenik sirozda görülmektedir. Kronik aktif hepatit hastalarının % 70 de ASMA yüksek titrede bulunmaktadır. Bu hastaların % 50 de ANA pozitif bulunduğu ve % 25 de düşük titreli AMA bulunduğu ispatlanmıştı. ASMA viral enfeksiyonlarda ve bazı normal kişilerde de düşük titrede bulunabilmektedir.

Anemi hastalarının % 90’ında GPA bulunmaktadır. Klinik ve laboratuar verileri pozitif GPA sonuçlarının otoimmün anemi ve diğer metabolizma anemilerinin ayırt etmekte yardımcı olduğunu göstermiştir. Veriler normal popülasyondaki 20 yaşın altında bulunan kişilerde % 2, 40 yaşı aşkın kadınlarda ve 60 yaşın üzerindeki kişilerde % 16 oranında GPA bulunduğunu ve oranın yükseldiğini göstermektedir.

İndirekt immünfloresan metodu ANA, AMA, ASMA ve GPA testleri için referans metoddur. Genel substratlar kemirici organlarının zayıf bölgeleri veya bazı tip hücre çizgileridir. NOVA Lite ANA KSL substratlarında genellikle fare böbreği, midesi ve karaciğerinin bölümleri kullanılmıştır. Konjugatlar ise zıt insan İgG içermektedir.

İndirekt immünfloresan tekniğinde, serumlar antijen substratları ile inkübe edilip, reaktif olmayan antikorlar yıkanmaktadır. Substratlar spesifik floresan konjugatları ile inkübe edilip Yıkama solüsyonu ile yıkanmaktadır. Pozitif serumlarda bulunan otoantikorlar floresan mikroskop altında elma yeşili renk vermelidir ve bu floresan, doku kesitinin içinden alınmalıdır.

 

 

Solüsyonlar

 

KSL Lamları ( Fare böbreği, midesi, karaciğeri ), 4 kuyucuklu. Böbrek ve mide kesitleri kuyucuğun üst kısmına, karaciğer kesitleri ise alt kısmına yerleştirilmiştir.

Floresanla işaretli zıt insan İgG konjugatı ( keçi ), evans blue ve % 0.1 sodyum azid içermektedir, 7.0mL

ANA Homojen pozitif kontrol ( insan ) % 0.1 sodyum azid, 0.5mL

İFA sistem Negatif Kontrol ( insan ) % 0.1 sodyum azid, 0.5mL

PBS konsantre 1000mL

Mounting Medium, % 0.1 sodyum azid, 7.0mL

Lameller

 

 

 

DİKKAT

 

Prezervatif olarak kullanılan sodyum azid ( % 0.1 ) zehirli olduğundan ve toksik etki gösterebileceğinden dikkatli olunmalıdır. Kalan Kimyasal solüsyonların kullanımdan sonra bütünüyle tamamen çalkalanarak temizlenmesi gerekmektedir.

 

 

ÖNLEMLER

 

1 Kontrollerin hazırlanmasında kullanılan insan kaynakları FDA belgeli kitlerle HCV, HbsAg ve HIV’e karşı test edilmiştir. Negatif olduğu belgelenmiştir. Hiç bir metod ve test kesin garanti vermemektedir. Bu nedenle test çalışmalarının büyük bir dikkat ve titizlikle yapılması önemle bildirilir.

 

2. Komponentler düzgün şekilde yerine konmadığı takdirde çelişkili sonuçlar çıkabilir.

 

3. Kontamine olmuş,hemolizli,lipemik ve ağır partiküller içeren serum örnekleri kullanılamaz, çünkü sonuçlar olumsuz etkilenebilir.

 

 

ÖRNEK

 

Çalışma sadece serum örneği ile gerçekleştirilmelidir. Serum ayrıldıktan sonra test edilene kadar 2-8 C de saklanmalıdır.-20 veya daha düşük C de uzun süre saklanabilir.

        

        

PROSEDÜR

 

 

MATERYALLER:

 

10          4 kuyucuklu substrat lamları

1            7.0mL FITC İgG Konjugatı

1            25mL PBS Konsantre ( 40X )

1            7.0mL Mounting Medium

1            0.5mL ANA Homojen

1            0.5mL İFA Negatif Kontrol

10          Lameller

        

 

GEREKLİ MATERYALLER

 

         Yıkama teknesi

         PBS sulandırmak için 1L lik şişe

15, 100mL mikropipetler

Distile veya deiyonize su

Pastör pipetleri, plastik şişe

Nemli ortam

Floresan mikroskop, 495nm yansıma ve 515nm barier filtreli.

 

 

 

 

 

 

 

 

İNOVA’dan alınabilecek isteğe bağlı solüsyonlar

 

AMA Kontrol 0.5mL

ASMA Kontrol 0.5mL

GPA Kontrol 0.5mL

 

 

METOD

 

1. PBS Konsantre solüsyonun sulandırılması: ÖNEMLİ: Dilüsyon 1L distile veya deiyonize su ile yapılmalı ve özenle karıştırılmalı. PBS solüsyonu serum örneklerini dilüe etmekte ve yıkama sırasında kullanılır. Hazırlanan PBS dilüsyonu 2-8 C de dört hafta stabildir.

         2. Serumların sulandırılması:

         A: Birinci aşama: Serumların sulandırılması 1:20 oranında ve dilüe edilmiş PBS solüsyonu ile yapılır ( 100mL serum üzerine 1.9mL PBS solüsyonu ilave edilir ).

B: Titrasyon: Bütün pozitif serumlara ilk aşamadaki dilüsyon üzerine seri dilüsyonlar yapılmalıdır ( 1:40, 1:80,………….1:1280 )

 

3. Substrat lamlarının hazırlanması: Substrat lamları paketinden çıkarılmadan önce oda ısısına gelmesi beklenmelidir. Lamların üzerinde serumların ve kontrollerin konacağı yerler işaretlenmeli ve lam nemli ortama yerleştirilmelidir. Daha sonra işaretli yerlere sıra ile birer damla ( 50-75mL ) pozitif ve negatif kontroller, dilüe edilmiş serumlar ilave edilmelidir.

4. İnkübasyon: Lamlar 30 dakika nemli ortamda inkübe edilmelidir ( kağıt bir havlu su ile nemlendirilerek altı düz bir cam veya plastik petri içine konarak uygun nemli ortam sağlanabilir. Prosedürde yer alan inkübasyon süresinde substratların kurumasına izin verilmemelidir. )

5. Lamların yıkanması: İnkübasyon sonrasında plastik bir şişeden sıkarak yada pipet yardımı ile serumlar dilüe edilmiş PBS solüsyonu ile yıkanır. Yıkama küçük miktarlarda dikkatle yapılmalı, serumların arasında sıçrama olmamalıdır. Lamları sarsmadan dilüe edilmiş PBS ile yıkama 5 dakika boyunca yapılmalıdır.

6. Floresan Konjugat ilavesi: Kalan PBS silkelenir. Lamlar nemli ortama geri konur. Üzerindeki her kuyucuğa dikkatle birer damla floresan konjugat ilave edilir. tekrar 30 dakika inkübe edilir.

         7. Yıkama: 5’ci bölümü tekrar et.

8. Lameller : Bu prosedür laboratuardan laboratuara değişir, bununla birlikte aşağıdaki prosedür önerilir :

         a) Lameller kağıt havlu üzerine konur.

b) Mounting Medium lamellerin üst kenarından alt kenarına kadar sürekli çizgi oluşana kadar uygulanır.

c) Lamlardaki PBS fazlası silkelenir. Lam alttan nazikçe tutulur ve üzerine mounting medium akıtılmış lamellerin üzerine arada hava kabarcığı kalmayacak şekilde kapatılır.

 

 

KALİTE KONTROL

 

Her bir çalışmada ANA İFA Homojen pozitif kontrol ve İFA Negatif Kontrolün seri olarak çalışılması testin güvenirliği ve doğru sonuç alınması açısından gereklidir. Çalışmada kullanılan kontrol serumları uygun insan serumlarından hazırlanmakta ve –70 C veya daha düsük derecede saklanmaktadır. Aşağıdaki listede bulunan değerler test sonuçları değerlendirilirken göz önünde bulundurulmalıdır.

 

 

 

 

Eğer aşağıdaki koşullar sağlanmazsa test sonuçları geçersiz sayılır ve çalışmanın tekrarlanması gerekir.

1.                ANA Homojen Kontrol ≥ 3

2.      İFA Negatif kontrol negatif olmalıdır.

 

SONUÇLAR

 

Negatif Reaksiyon

 

Serum, spesifik boyama sonucu negatif kontrole eşit yada düşük olur ise negatif olarak kabul edilir. Serumlar içerdikleri heterofil antikorlar yada düşük dereceli antikorlara, sitoplazmik ögelere ve kontraktil proteinlere göre farklı backroundlar sergilerler.

 

ANA Pozitif reaksiyon

 

Hücrenin çekirdeği spesifik olarak boyanır. Boyamada spesifik antikorlar nedeni ile değişik örnekler gözlenir. Bu örnekler homojenleri, benekleri, çekirdekleri ve rimi kapsar.

 

AMA Pozitif Reaksiyon

 

Böbrekte iç ve dış tübüllerler granüllü boyanır. Midedeki metabolik aktif parietal hücreler yüksek konsantrasyonda mitokondri içerirler ve pozitif boyanırlar.

 

ASMA Pozitif  reaksiyon

 

Böbrekte bulunan iç kas çizgileri spesifik boyanmaktadır ve midedeki kas çizgilerin boyanması da ASMA için spesifiktir.

 

GPA Pozitif Reaksiyon

 

Parietal hücrelerin sitoplazması boyanır. Bu hücreler midenin mukoza dokusunda yerleşik bulunmaktadır. AMA pozitif hastalarda da parietal hücreler boyanmaktadır ( sitoplazma boyanması ), bu nedenle GPA için rapor vermeden önce böbrek tübülerleri kontrol edilmelidir. Eğer serumda GPA pozitif ise böbrek tübülerleri negatif olacaktır.

 

PROSEDÜRÜN SINIRLARI

 

1. Yüksek titrede ANA bağ doku hastalıklarını gösterir fakat teşhiste sadece bu sonuç dikkate alınmamalıdır. ANA sonuçları, diğer serolojik hastalıklara ve hastanın klinik geçmişine dikkat çekmektedir.

 

2. Serum sulandırılmadı ise ANA patternleri sık sık değişir. Bu bulgulara göre, düşük titredeki antikorlar sulandırılmış serumlara nazaran testin duyarlılığını azaltmaktadır.

 

3. Kitin kendi komponentleri dışındaki değişik faktörler testin duyarlılığını etkiler. Kullanılan floresan mikroskobun lamba gücü, yaşı, büyütme ayarı, filtre sistemi ve kullanıcının dikkati.

        

4. Eğer 515nm bariyer filtresi yerine band pas filtresi kullanılırsa artefaktların boyandığı görülecektir.

 

5. Lamların üzerinde sadece bir tip kalem kullanılmalıdır aksi taktirde artefakt boyanması artacaktır.

 

 

 

6. Kullanılan cam malzemeler güzelce yıkanmalı ve boya artıklarından arındırılmalıdır. Kullanılan yıkama banyosunun temizliği de önemlidir.

 

 

BEKLENEN SONUÇLAR VE SPESİFİK PERFORMANS KARAKTERİSTİĞİ

 

NOVA Lite ANA KSL substratları ile bağ doku hastaları otoimmün karaciğer hastaları ve Permisius anemi hastalarından oluşan 200 dönor test edildi. Sonuçlar aşağıdaki tabloda

 

 

                                               Pozitif No.

                                               NOVA Lite KSL

 

Hasta grubu                                      #       ANA             AMA            ASMA          GPA

 

SLE                                         105   101             5                 9                 1

İlaca bağlı Lupus                      24     24               0                 0                 0

Röm. artrit                               40     28               1                 1                 0

Kron. aktif Hepatit          25     10               4                 21               0

Primary Biliary Sirosis               30     5                 27               3                 0

Pernicious anemi                     15     0                 0                 0                 14

Normaller                                 200   3                 2                 6                 1

 

 

* Toplam pozitif sayısı hasta sayısından fazla görülebilir, bu durum bir hastada birden çok patern görüldüğünü gösterir.